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形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物
发布时间:2019-04-04   点击次数:147次

戊二醛二步法

1) 原理:戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

2)标记步骤:

(1) 称取HRP25mg溶于1。25%戊二醛溶液中,于室温静置过一夜。

(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟,收集棕色流出液。如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中,缓慢搅拌。

(3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。

(4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3?小时。)

(5) 加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时。

(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时。

(7) 3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,zui后沉淀物溶于少量0。15M PH7。4的PBS中。

(8) 将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。

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